Open Column Chromatography

Pada artikel sebelumnya telah disebutkan beberapa tipe open column chromatography, berdasarkan fase diam yang dipakai, yaitu antara lain Silica gel (SiO2), ODS (Octadecylsilane), Sephadex, dan juga ion exchange resin(Diaion). Pada artikel ini, akan lebih fokus menjelaskan mengenai teknik isolasi senyawa tunggal dengan metode kolom, yang meliputi: pembuatan kolom (packing column), persiapan ekstrak sampel, pembuatan pelarut/fase gerak (eluent), aplikasi sampel atau elusi, serta koleksi fraksi-fraksi terelusi. Masing-masing jenis kolom tersebut memiliki teknik yang sedikit berbeda, tapi prinsipnya sama. Nah, sebelum itu akan dijelaskan terlebih dahulu perbedaan prinsip dari masing-masing jenis kolom tersebut.

Kolom silica gel termasuk dalam kromatografi fase normal (normal phase), karena fase diamnya bersifat polar. Sebenarnya fase asli silica tidak bersifat polar, dan berbentuk padat/granul/powder, tetapi ketika diaplikasikan dalam sebuah kolom bersama eluent makan sifatnya berubah menjadi polar, dan berubah menjadi gel (karakteristik silica gel akan dibahas pada artikel terpisah). Untuk fase diam silica gel ini menggunakan eluent berupa larutan dengan berbagai persentase antara chloroform (CHCl3), methanol, dan air, di mana perbandingan antara choloroform dan methanol sebaiknya genap 100 %, dan ekses air 10 %. Sebagai contoh chloroform:methanol:air (C:M:W)= 60:40:10, atau 70:30:10 dan sebagainya. Yang paling berperan di sini adalah choloroform dan methanol, karena keduanya bersifat saling larut (miscible), dengan indeks polaritas yang tidak jauh berbeda. Sedangkan penambahan air selain sedikit mempengaruhi polaritas, juga berfungsi sebagai penutup dari campuran kedua pelarut tersebut, sehingga tidak menguap bebas, sama prinsipnya dengan water closed pada toilet. Pemilihan eluent didasarkan pada tes awal menggunakan TLC (baca di sini).

Sebelum melakukan packing column, solvent (sama dengan eluent, tetapi istilah eluent dipakai jika solvent diaplikasikan pada saat proses elusi kolom) sudah harus disiapkan karena silica yang berbentuk serbuk, harus dilarutkan dulu dengan solvent di atas sampai berwujud gel. Gel inilah yang kemudian dituangkan ke dalam kolom. Proses ini dinamakan packing coloumn. Kolom yang baik adalah jika fase diamnya terbentuk secara rapat/ketat, dalam arti tidak ada rongga udara (bubble) atau strukturnya yang tidak rapuh, untuk itu sebelum sample ekstrak diaplikasikan, perlu dipastikan dulu kolom ter-packing dengan baik yaitu dengan mengelusikan eluent terlebih dahulu beberapa jam.

Pada open column chromatography, sampel yang akan dielusikan (diiosolasi), berdasarkan fasenya dibedakan menjadi dua yaitu dry phase (fasesolid/kering/serbuk) dan wet phase (liquid). Untuk kolom silica gel dan ODS biasanya dalam bentuk dry phase, sedangkan Sephadex dan Diaion menggunakan metode wet phase. Untuk kolom silica gel, ekstrak yang akan dielusi harus di-mix dengan silica gel. Tahap pertama, ekstrak dilarutkan terlebih dahulu dengan methanol dalam sebuahevaporating flask (gelas untuk evaporasi menggunakan rotary evaporator), kemudian ditambahkan silica gel secukupnya, diperkirakan seluruh ekstrak dapat ter-mix dengan sempurna (semakin kecil volume silica gel yang digunakan lebih baik, karena selain efisien juga tingkat presisi untuk isolasi lebih baik). Kemudian campuran larutan ekstrak dan silica gel tersebut dievaporasikan sampai terbentuk granul-granul, di mana ekstrak sudah terabsorbsi dalam silica gel. Granul ini harus dilembutkan menggunakan mortar sehingga diperoleh fase serbuk, yang kemudian baru bisa diaplikasikan dalam kolom kromatografi.

Pada aplikasi sampel ke dalam kolom, ada beberapa hal yang harus diperhatikan, antara lain: (1) Volume eluent di atas fase diam disisakan seminimal mungkin, sekiranya seluruh sampel dapat terendam. Hal ini penting agar level isolasi presisi. (2) Jangan sampai sampel terlarut pada eluent yang posisinya berada di atasnya, diusahakan senyawa dalam sampel terelusi dengan baik mengikuti arah alir eluent dalam kolom. Jika hal ini terjadi, maka proses isolasi tidak akan berlangsung dengan baik. (3) Dijaga agar eluent tetap mengalir dengan flow rate yang rendah dengan tujuan sampel dapat terelusi ke bawah mengikuti aliran eluent dan mencegah sampel terlarut oleh eluent/solvent di bagian atasnya. (4) Aplikasi sampel dilakukan seperti menaburkan gula dalam minuman kopi, tetapi harus dilakukan dengan perlahan-lahan dan merata, agar sampel dapat terposisikan merata dengan struktur yang baik pada permukaan atas fase diam.

Tahap selanjutnya adalah proses elusi. Hal yang perlu diperhatikan di sini adalah laju alir atau flow rate, kemudian volume koleksi, serta waktu kapan fraksi mulai dikoleksi. Flow rate yang terlalu rendah menyebabkan waktu isolasi terlalu panjang, sehingga tidak efisien, sedangkan jika terlalu cepat dikhawatirkan proses isolasi tidak berhasil, karena senyawa tidak terfraksinasi dengan baik. Penentuan volume koleksi fraksi juga ditentukan dengan memperhatikan efektifitas dan efisiensi proses, volume yang terlalu tinggi menyebabkan kehilangan kuantitas senyawa tunggal yang signifikan, karena terkontaminasi dengan senyawa lain pada fraksi sebelum atau sesudahnya. Volume yang terlalu rendah akan menyebabkan pengecekan keberadaan senyawa tunggal menggunakan TLC akan banyak dan merepotkan. Jika memang sampel dalam jumlah yang besar dan menggunakan kolom berdiameter lebar maka volume lebih tinggi dapat diaplikasikan, sedangkan jika sampel sangat sedikit dengan ukuran kolom yang kecil maka koleksi dalam volume yang rendah lebih disarankan. Koleksi dapat menggunakan tabung reaksi dengan berbagai ukuran, mulai dari 10 ml sampai 50 ml. Dapat juga dengan menggunakan alat auto sampler yang secara otomatis dapat mengoleksi fraksi.

Sementara penjelasan untuk open column chromatography dipotong sampai di sini dulu. Pembahasan selanjutnya diberikan pada artikel yang lain. Semoga bermanfaat….